m6A RNA甲基化測序
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發現microRNA，circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有發生m6A修飾。 m6A修飾主要發生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉甲基化；m6A由m6A結合蛋白識別，目前發現m6A結合蛋白（讀碼器）有YTH結構域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。在基因表達、蛋白翻譯和RNA剪切等正常生物過程中具有重要作用。近來有研究顯示m6A RNA甲基化在乳腺癌、惡性血液病、膠質母細胞瘤、宮頸癌等多種癌癥的發生發展中具有重要作用。
圖 1 m6A修飾的酶系統 圖 2 m6A生物學功能
一、MeRIP-seq實驗流程
圖3 英拜 m6A RNA甲基化測序實驗流程
二、m6A甲基化測序分析內容
u 測序數據質量評估及QC
u 測序序列與參考基因組比對
u RNA甲基化peak calling
u peak在基因組中的分布及注釋
u Peak在基因組中富集程度統計
u 差異RNA甲基化區域分析
u 差異RNA甲基化區域GO與KEGG富集分析
三、研究案例
1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
DNA甲基化異常是膠質瘤的表觀遺傳調控因子，但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質瘤（GBM）中的調控還尚未清楚。為研究m6A調節可能導致GBM患者臨床療效不佳，作者通過TCGA數據庫，發現ALKBH5在惡性膠質瘤樣干細胞（GSCs）中高表達且與GBM 病人不良預后相關，干擾ALKBH5 降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，進一步體內驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
為研究ALKBH5的m6A作用機制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質瘤增殖相關的FOXM1，最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調節FOXM1在GSCs中的表達。
為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調節，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發現lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補，且共表達、共定位，進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖，從而維持GSCs的干性。
圖4 ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progressionthrough YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)
表觀遺傳改變極大地促進了人類癌癥的發生。傳統的表觀遺傳研究主要集中在DNA甲基化，組蛋白修飾和染色質重構。最近，RNA各種可逆的化學修飾被認為是一種新的表觀遺傳調控方式。m6A是真核生物mRNA最常見的化學修飾，在調控mRNA穩定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。
作者使用轉錄組測序發現了METTL3（甲基轉移酶3），一種主要的RNA N6-腺苷-甲基轉移酶，在人肝細胞癌（HCC）和多種實體腫瘤中顯著高表達。在臨床上，METTL3的過度表達與肝細胞癌患者不良預后有關。體外實驗證明敲除METTL3會顯著抑制HCC細胞增殖，遷移及克隆形成。體內實驗證明敲除METTL3會明顯抑制HCC體內成瘤和肺轉移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系統，內源性高表達METTL3會顯著促進HCC細胞在體外和體內生長。通過轉錄組測序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細胞因子信號2的抑制因子）作為METTL3介導的m6A修飾的下游靶基因。 敲除METTL3表達會消除SOCS2 mRNA m6A修飾并增強SOCS2 mRNA表達。m6A介導的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2?？傊?，METTL3在HCC大部分高表達中,并通過m6A-YTHDF2依賴機制抑制SOCS2表達從而促進HCC進展。因此，作者發現了在肝腫瘤發生過程中表觀遺傳改變的一種新機制。
圖5 RNA甲基化轉移酶METLLT3在肝癌組織中高表達
（轉錄組測序結果及TCGA數據庫分析）
3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
在許多不同種類的RNA中，都已觀察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在microRNAs中還沒有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3細胞系中，通過敲除m6A甲基轉移酶FTO篩選到表達差異的microRNA,說明miRNA受m6A甲基化的調控。進一步通過MeRIP-Seq發現相當一部分的microRNA具有m6A修飾。通過motif分析，他們發現了區分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。該文章所述的表觀遺傳修飾在基因表達的轉錄后調控的復雜性上增加了一個新的層次。
圖7 FTO敲除對甲基化的miRNAs的穩定狀態的影響。
四、送樣要求
A樣品要求：
樣品類型：細胞、新鮮組織或RNA樣品。
樣品量：細胞樣品請提供至少5×107~108個細胞，組織樣品請提供至少5g的組織塊，RNA樣品請提供500μg以上的總RNA。
樣品質量：RNA無明顯降解，提取的總RNA OD260/280值在1.8～2.2之間，濃度 ≥ 500ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊（切成～50mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護劑處理或液氮凍存后，-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復凍融。
樣品運輸：樣品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰運輸。
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